HBV耐药变异检测方法的选择

[摘要]目的通过了解现有HBV耐药变异的检测方法，探讨这些检测方法的原理和试验方法的价值，选择适合目前临床实验室条件和水平的检测方法。

关键词：病毒乙肝耐药检测

中图分类号：R511 文献标识码：B 文章编号：1004-7484（2011）11-0215-02

据世界卫生组织报道，全球约三分之一的人曾感染过乙型肝炎病毒（HBV），其中3.5至4亿人口为慢性HBV感染者，每年约有超过100万人死于HBV感染所致的原发性肝癌、肝衰竭、肝硬化[1]。我国属于HBV感染高流行区，HBsAg阳性率达9.09%，即约9300万HBsAg携带者。其中乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者达3000万人以上，10%～30%的CHB患者经10～30年可发展为肝硬化，约1%～5%的患者经20～40年会发展为肝癌[2]。核苷（酸）类似物是目前临床上治疗慢性乙型肝炎（慢乙型）的重要抗病毒药物。国内外已批准上市的核苷（酸）类似物分有四种：拉米夫定、替比夫定、阿德福韦酯和恩替卡韦。以上四种药物通过直接抑制HBV-DNA复制，改善肝脏组织学病变，延缓和减少乙肝病情进展，疗效得到肯定。但因该类药物对HBVCCCDNA无直接作用，需长期使用，易导致乙型肝炎病毒（HBV）产生耐药变异，如拉米夫定治疗一年耐药变异率为15%～30%，第4～5年耐药变异率可高达65%～75%[3]。临床医师应当合理制订抗病毒治疗方案，减少耐药变异的发生，同时监测病毒耐药变异情况，及时采取有效应对策略。

为帮助临床实验室选择适合各自实验室水平的检测方法，本文总结了现有HBV耐药变异的检测方法及其这些检测方法的原理和特点。

1基因型耐药的检测方法

由于表型耐药检测对技术和实验室要求极高，现在所有指南将基因型耐药检测检测作为NA抗病毒治疗常规检测。对于NA治疗过程中出现病毒学突破的患者应进行基因型耐药检测。目前可用的方法包括以下几种：

限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析：本法具有较强的灵敏性，能检测出在病毒总体中大于5%的突变株。然而PCR-RFLP只能检测已知的单个位点的变异，对于每一个可能的突变，必须特别设计单独的核酸内切酶。随着多种NA的相继应用和HBV耐药变异点的不断出现，该法已难以胜任多位点的耐药变异的临床检测。

反向杂交测定法LiPA DR(reverse hybridization assay)：基于该技术的INNO―LiPA方法在国外已应用于临床检测。该法敏感性好可检测变异株占HBV准种池5%～10%的样品。但它只能检测已知的位点变异，并且每个变异都需要一组特异性的探针。即检测1个单核苷酸的变异需要多个探针。基因芯片测序法：具有快速、高效、敏感、平行化和自动化的优点，可检测已知变异位点。另外随着高通量测序技术的进步，还可用于检测未知变异位点。以上两个方法因为价格昂贵，均未获得临床广泛应用。

焦磷酸测序法（pyrosequencing）：该法具有高通量、高灵敏度的优点。当变异病毒株达5%～10%时即可检出。在拉米夫定的耐药检测上与直接测序法符合率高，是一种新兴的基因测序技术。

PCR产物的直接测序法（direct PCR sequencing）：是将HBV基因级的逆转录酶区进行扩增后直接进行测序的分析方法。PCR产物直接测序法适用于各种突变的测定，可检测已知和可能的未知耐药变异点，是最常用的基因型耐药检测方法之一，被认为是基因型耐药检测的金标准[4]。本实验室进行的研究即采用PCR产物的直接测序法，研究对象为接受NA治疗中发生病毒学突破的CHB患者，对NA相关的HBV P基因区的11个耐药位点进行定量测定和分析，取得了较高的阳性率（81.1%）。

2体外表型分析

体外表型分析（in vitro phenotypic analysis）是确认基因型耐药的“金标准”，常用半数有效浓度（50% effective concentration，EC50）或半数抑制浓度（50% inhibitory concentration，IC50）来评价耐药程度的高低。其原理将含有待测耐药变异位点的HBV全基因组导入肝细胞来源的细胞系，再将不同浓度梯度的NA加入细胞培养液中，经过一定时间培养后检测HBV-DNA的复制情况，计算EC50与野生株的比较，判断所测基因变异对药物的敏感性[5]。

3虚拟表型分析

虚拟表型分析（virtual phenotypic analysis）的基础是建立包含相互关联的临床资料、基因型和表型耐药品信息的HBV耐药变异数据库。当向基提交一份待分析序列时，数据库会查找与该序列最匹配的HBV序列，然后根据匹配序列的临床以有耐药检测情况来推断待分析序列的耐药变异情况。

参考文献

[1] Liaw Y F,Chu C M.Hepatitis B Virus Infection [J]. Lancer, 2009, 373 (9663):58 2～592.

[2] Simmods P.The orgion and evolution of hepatitis viruses in humans.J Gen Virol,2001,82:693～712.

[3] Angus P,Vanghan R,Xiong S,et al Resistance to adefovir dipivoxil therapy associated with the selection of a novel mutation in the HBV polymerase[J].Gastroenterology,2003,125,292～297.

[4] Keeffe EB,Dieterich DT,Han SH,et al.A treatment algorithm for the management of chronic hepatitis B virus infection in the United States:2008 update [J].Clin Gastroenterol Hepatol,2008,6,1315～1341.

[5] Shaw T,Bartholomeusz A,Locamini S.HBV drug resistance: mechanisms,detetction and interpretation[J].J Hepatol,2006,44,593～606.