LncRNA―AK058003诱导肝癌细胞凋亡的作用机制

[摘要] 目的 探讨lncRNA-AK058003在肝癌细胞凋亡中的作用机制。 方法 采用lip2000转染法分别将过表达质粒（lncRNA-AK058003组）和空质粒（Vector组）转入HepG2和SMMC-7721细胞株，应用流式细胞术和蛋白质免疫印迹法来检测凋亡细胞及凋亡相关蛋白。 结果 构建上调lncRNA-AK058003的表达质粒，转染HepG2和SMMC-7721细胞株后，凋亡细胞数和凋亡率明显高于Vector组（P < 0.05）；过表达lncRNA-AK058003能抑制MAPK信号通路关键磷酸化蛋白的表达。 结论 lncRNA-AK058003能够调控MAPK信号通路促进肝癌细胞凋亡。

[关键词] lncRNA-AK058003；肝癌；MAPK通路；凋亡

[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）09（c）-0023-04

[Abstract] Objective To explore the mechanism of lncRNA-AK058003 in liver cancer cells apoptosis. Methods Flow cytometry and protein immunoblot methods were applied to detecting cell apoptosis and related proteins， after transfected lncRNA-AK058003 or vector in HepG2 and SMMC-7721 cells with lip2000. Results Transfected HepG2 and SMMC-7721 with construction of over-expression lncRNA-AK058003 plasmid， the number of apoptotic cells and apoptotic rate are significantly higher than the empty plasmid group （P < 0.05）. The key phosphorylated proteins of MAPK signal pathway were suppressed by lncRNA-AK058003. Conclusion LncRNA-AK058003 can promote liver cancer cells apoptosis by adjusting MAPK signaling pathways.

[Key words] lncRNA-AK058003； Liver cancer； MAPK signal pathway； Apoptosis

原发性肝癌是全球常见的恶性肿瘤之一，其中男性肝癌死亡率在肿瘤相关性死亡中位居第二[1]，而肝癌发生发展的分子机制仍不明确。前期研究表明肝癌的发生与细胞凋亡分子和信号通路异常相关[2-4]。因此从分子水平研究肝癌细胞凋亡的机制，并将特异性分子作为临床治疗新靶点。

长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是近年来备受瞩目的一类长度大于200 nt的非编码RNA，其位于细胞核与细胞质中，是RNA聚合酶Ⅱ转录的副产物[5-7]。由于lncRNA无开放阅读框，所以没有或很少具有编码蛋白质的能力，主要是以RNA形式，在表观遗传学（包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重构）、转录调控（通过募集或者干扰一些转录因子在蛋白编码基因上游启动子区定位，而影响下游基因的表达）及转录后水平调节基因的表达[8-9]。目前，已有文献证实部分lncRNA在肿瘤凋亡中发挥重要作用[10-11]，而lncRNA与肝癌凋亡相关的文献相对较少。因此，深入探讨lncRNAs在肝癌凋亡的作用及其分子机制，将有助于全面地了解肝癌发生的过程。

1 对象与方法

1.1 细胞培养

人肝癌细胞系HepG2和SMMC-7721购于中科院上海细胞库，按照50%培养基，40%血清和10%DMSO进行梯度冻存，保存于液氮中。HepG2采用含有10% Gibico胎牛血清和1%青-链霉素的Hyclone DMEM培养基，而SMMC-7721在含10% Gibico胎牛血清和1%青-链霉素的Hyclone RPMI培养基置于37℃、5%CO2细胞培养箱培养。

1.2 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）

将构建的过表达质粒及空质粒分别转染HepG2和SMMC-7721细胞。转染48 h后，用Trizol提取总RNA[12]，并用Nano-Drop2000C紫外分光光度计测定RNA浓度及纯度。然后按TOYOBO试剂盒（QPK-201，日本）说明书将RNA反转录成cDNA。最后按照Takara qRT-PCR试剂盒说明书进行操作，设立3个复孔，GAPDH为内参基因，7500 Fast System SDS软件分析Ct值，采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。引物序列由武汉巴菲尔生物有限公司设计合成：GAPDH-F：5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTG-3'；GAPDH-R：5'-AGGG GCCATCCACAGTCTTC-3'；AK058003-F：5'-GGGAAC AAAGATGGTTTCTACGT-3'；AK058003-R：5'-ACTGGT TCATAGTTAGGCTGGAT-3'。

1.3过表达lncRNA-AK05800质粒的构建

用PCR仪扩增并获取目的基因，琼脂糖电泳进行验证。然后将10 μL的PCR产物与载体GV144（上海吉凯基因化学技术有限公司）交换反应产物转化到100 μL感受态细胞E.coli中，取适量菌液均匀涂布在含有卡那霉素抗性的琼脂糖平板，置于恒温培养箱中培养16 h。最后对菌液和质粒进行PCR鉴定和测序。

1.4 脂质体转染人肝癌细胞系

细胞融合度达50%～80%时，更换成无血清培养基培养2 h。分别用Optimem稀释lip2000（Thermo，Invitrogen）和质粒，静置5 min后将两者轻轻混合，室温孵育20 min加入培养皿内继续培养[10]。

1.5 细胞凋亡检测

收集转染48 h的肿瘤细胞上清，用胰酶消化细胞，PBS洗涤两次，用凋亡试剂盒（杭州联科生物技术股份有限公司）240 μL 1xBinding buffer重悬细胞，调整细胞浓度为2×105/mL，加入5 μL Annexin V-APC和10 μL 7-氨基放线菌素D（7-AAD）轻轻混匀，室温避光反应30 min，再加入260 μL 1×Binding buffer稀释。用流式细胞仪分析（Becton-Dickinson，USA），采用FACS express version 3软件分析结果。

1.6 蛋白质免疫印迹实验（Western blot）

提取肝癌细胞系总蛋白，4℃，12 000 r/min离心5 min，将上清分装到1.5 mL的离心管中放于-20℃保存。制备SDS-PAGE凝胶，根据蛋白浓度计算出上样体积，与上样缓冲液1∶1混匀，沸水浴30 min，加样。60 mA恒流电泳约1 h，转膜，封闭，一抗过夜孵育（表1），二抗（生物素标记山羊抗兔IgG 1∶10 000）孵育，漂洗，经ECL试剂盒（BestBio，上海）显色，凝胶成像系统扫描处理。通过Pathway分析预测lncRNA-AK058003与MAPK信号通路相关，采用Western blot检测MAPK信号通路中的3个主要蛋白：ERK、P38、JNK及磷酸化的蛋白。

1.7 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA-AK058003质粒构建和克隆筛选

构建lncRNA-AK058003过表达的质粒（图1A），以琼脂糖凝胶电泳初步表明lncRNA-AK058003目的序列成功与载体结合（图1B）。经测序分析，进一步证明重组体中含过表达的目的片段，且碱基序列完整（图1C）。

2.2 瞬时转染肝癌细胞系后lncRNA-AK058003表达

RT-PCR及qRT-PCR结果显示：HepG2和SMMC-7721转染lncRNA-AK058003组显著高于Vector组，差异均有高度统计学意义（P < 0.01），见图2。结果显示，瞬时转染lncRNA-AK058003成功。

2.3 lncRNA-AK058003促进肝癌细胞凋亡

流式细胞术检测显示：在HepG2中过表达lncRNA-AK058003后凋亡细胞数增多（图3A～B），凋亡率明显高于Vector组（P < 0.01）（图3E）；同时也在SMMC-7721中进行检测，过表达lncRNA-AK058003后凋亡细胞数和凋亡率均显著高于Vector组（P < 0.05）（图3C～E）。为了证明lncRNA能诱导肝癌细胞凋亡，采用Western blot检测了凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3的蛋白变化。如图3F所示：过表达lncRNA-AK058003后，促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达量较空质粒组增高，而抑制凋亡蛋白Bcl-2表达量降低。进一步证明lncRNA-AK058003能促进肝癌细胞凋亡。

2.4 lncRNA-AK058003与MAPK信号通路的关系

过表达lncRNA-AK058003的HepG2中P-ERK，P-P38及P-JNK蛋白变化较Vector组显著降低，然而ERK和P38蛋白的变化不显著，说明lncRNA-AK058003可能参与抑制MAPK信号通路的激活。见图4。

3 讨论

细胞凋亡是为调控机体的发育和维护内环境稳定，由基因控制的主动程序性死亡的过程[13]。有学者认为肿瘤的无限制增长是肿瘤细胞的凋亡机制失控所致[14]。最近的研究表明，凋亡诱导疗法是一种安全有效的抗癌方法，从而可能成为癌症治疗方式之一[15]。因此，寻找诱导肿瘤细胞凋亡的基因有助于开辟肿瘤治疗的新天地。本研究首次探讨了lncRNA-AK058003与肝癌细胞凋亡的关系，通过上调lncRNA-AK058003的表达，进行流式细胞术和Western blot实验，发现lncRNA-AK058003能够诱导肝癌细胞凋亡，增加促进凋亡相关蛋白的表达，并且可以抑制MAPK信号通路的激活。

前期的研究中，Wang等[16]在胃癌中新发现缺氧lncRNA-AK058003通过正向调控SNCG的CpG岛甲基化来促进肿瘤的侵袭转移。同时He等[17]在乳腺癌中发现LncRNA-AK058003通过调控γ-synuclein的表达水平促进乳腺癌的增殖、侵袭和转移。这两项研究均表明lncRNA-AK058003在肿瘤中发挥着重要的作用，却没有讨论该基因与肿瘤凋亡的关系。另外，Ma等[10]发现肿瘤坏死因子能够诱导lncRNA-HULC调节miR-9的表达促进肝癌细胞凋亡；Huang等[11]研究表明，lncRNA-TUG1在核转录因子（SP1）诱导下抑制KLF2蛋白表达，促进肝癌细胞的增殖，抑制肿瘤细胞凋亡。前两项研究均探讨了lncRNA参与肝癌细胞的凋亡的分子机制，未对具体信号通路进行研究。近期的研究发现MAPK信号通路的异常与肝癌的进展和不良预后密切相关[18-20]。这些研究均表明，lncRNA和MAPK信号通路在肝癌的发生机制中扮演着重要的角色。

当然，本研究仍然存在不足：①没有检测临床标本lncRNA的表达量；②检测方式单一；③lncRNA-AK058003调控MAPK信号通路的机制不明确。本研究组后期的研究将对lncRNA-AK058003在肝癌组织中的表达量进行检测，并探讨该基因在肝癌发生中的分子机制。

综上所述，研究发现lncRNA-AK058003能够调控MAPK信号通路诱导肝癌细胞凋亡。这将为肝癌的发生、发展、诊断和预后判断、新治疗靶点提供理论依据，有着重要的临床意义。

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