抗逆性转录因子NAC的生物信息学分析

摘要：根据在NCBI中已登录的植物转录因子NAC家族中与抗逆性有关成员的核苷酸序列和氨基酸序列，应用生物信息学软件分析了其理化性质、疏水性/亲水性、跨膜结构、二级结构、功能结构域等，并构建了这类NAC家族成员的系统进化树。结果表明，17种NAC成员的蛋白质一级结构中存在明显的疏水区和亲水区，都存在明显的-螺旋和β折叠。二级结构组成上相似，都由-螺旋、β折叠和无规则卷曲组成。这些成员都能够通过同源建模分析NAC蛋白质的三维结构。进化分析表明，它们主要分成4大类群。通过多序列比对得到了这些成员的保守区段，并设计了简并引物。

关键词：转录因子；NAC；生物信息学分析；抗逆性

中图分类号：R318.04 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）17-4199-06

Bioinformatics of the Transcription Factor NAC with Stress Resistance

KANG Mei-ling， ZHOU Zhen-hua， TIAN Zhong-jing， MING Dong-feng， MA Li

（College of Life Science， Zaozhuang University， Zaozhuang 277160，Shandong，China）

Abstract：Physicochemical property， hydrophobic/hydrophilic，membrane structure，secondary structure，functional domains of resistance-realated members in the family of plant transcription factor NAC were analyzed with bioinformatics. The results showed that primary structure of 17 NAC members had obvious hydrophobic and hydrophilic areas， -helix and β-sheet were discovered in their primary structure prediction. Their secondary structure was composed of -helix， β-sheet and irregular curl. Three-dimensional structure of the NAC proteins was established by homology modeling. Phylogenetic analysis showed that they were divided into four groups. By the alignment of multiple sequence，conservative sections of these members were obtained and a pair of primer was designed. The work will pave the way for further studing the expression regulation of the NAC transcription factors related with resistance.

Key words：transcription factor；NAC；bioinformatics analysis；resistance

生物体内有大量的转录因子存在，它实际上是一种反式作用因子，存在于众多不同的信号转导途径中，可以特异地与顺式作用元件结合，从而调控目标基因的表达，是各种生化生理活动调节的关键所在[1]。根据DAN结构域的不同可以把转录因子分为很多家族，其中NAC家族就是一种具有多种生物功能的植物特异转录因子。1996年，Souer等[2]在矮牵牛中获得了第一个NAC基因。之后，研究者在拟南芥中发现了CUC2[3]。CUC2和NAM同属于NAM亚族，水稻的ONAC300、金鱼草的CUP和南瓜的CmNACP也属于这个亚族[4]。Vroemen等[5]从拟南芥中分离到与CUC1和CUC2同源的CUC3。CUC促进茎尖分生组织的分化，参与器官边界的形成。随后，AtNAM的发现及其相关功能的研究表明，分生组织的形成和器官边界的建立与AtNAM密不可分[6]。2003年，Ooka等[7]首次将NAC家族分为2个大组和18个亚组。之后对NAC亚家族成员的研究基本上都是以Ooka的分类为依据展开的。作为具有重要功能的转录因子，利用生物信息学的方法对其进行全面分析，有助于获取关于NAC家族更多的信息，从而为其功能基因组学的研究提供更为详尽的数据。

1 转录因子NAC的结构特点与生物学功能

NAC转录因子有着鲜明的特点，在其蛋白质的N端有高度保守的约150个氨基酸组成的NAC结构域。NAC结构域不包含任何已知的蛋白质结构域，而是由几个不规则的卷曲螺旋围绕着一个扭曲的β-折叠片构成，与典型的螺旋-转角-螺旋结构有较大差别[8]。典型的NAC蛋白质的N端有一段高度保守区，该区可进一步分成A～E五个亚结构域，可结合蛋白质或DNA，也可参与二聚化过程。碳端是高变区，对转录过程起调控作用[9]。

NAC转录因子是植物中最大的转录因子家族之一，广泛分布于苔鲜植物到高等双子叶植物中。研究表明，NAC转录因子具有诸多生物功能，详见表1。

2 数据与方法

从NCBI网站的GenBank数据库中筛选了17种NAC家族中与抗逆性有关的核苷酸序列及其对应的氨基酸序列，以此作为试验分析数据（表2）。

分析方法：NAC编码蛋白质的理化性质采用Protparam预测；疏水性/亲水性采用ProtScale进行预测；跨膜结构域采用TMPred预测；卷曲螺旋采用COILS预测；蛋白质二级结构采用GOR4预测；蛋白质亚细胞定位采用WOLF PSORT预测；蛋白质三维结构分析与同源建模采用CPHmodels和RasMol-Raindy进行；进化树的构建采用软件ClustalW2和MEGA 4.1进行分析，各分析软件的网址见表3。

3 结果与分析

3.1 蛋白质的一级结构分析

3.1.1 氨基酸序列的理化性质分析 利用在线分析软件Protparam对17种NAC家族成员逐一进行分析，得出对应氨基酸序列的理化性质分析结果。结果（表4）表明，这些成员的氨基酸残基数为293～464，分子量为33 164.7～51 493.5，差异比较小，PI值多在6～8范围内。经分析发现，含量最丰富的氨基酸有Ser、Gly、Pro、Ala等。这些氨基酸使蛋白质序列有较多的负电荷。通常不稳定系数小于40，则认为该蛋白质是稳定的，反之则不稳定。供试的17种NAC成员有8种是不稳定的，推测这8种成员在植物体内可能是阶段性出现，如在受到胁迫诱导时才会表达的一些蛋白质，会表现出一定的不稳定性，而长期存在于植物体内的NAC成员则相对稳定。另外，这17种成员的平均疏水性皆为负值，都在-0.6左右，说明这些蛋白质是亲水性蛋白质。

3.1.2 疏水性/亲水性的预测和分析 蛋白质亲疏水性氨基酸的组成是蛋白质折叠的主要驱动力，通过亲水性预测可以反映蛋白质的折叠情况。蛋白质疏水区域可以作为评判潜在跨膜区的参考依据。采用ProtScale对17种NAC家族成员蛋白质序列进行分析（图1），发现这17种成员在40～50区、110～130区有较强的疏水性，表明这些区段很可能以-螺旋的形式存在，在60～80区域有着强烈的亲水性，表明该区段是由一些非-螺旋的二级结构组成。

3.1.3 跨膜结构的预测和分析 跨膜结构是蛋白质和膜内在蛋白质通过静电作用和氢键键合作用与膜结合而形成的一段氨基酸片段，一般由20个左右的疏水性氨基酸残基组成，主要形成-螺旋。用在线工具TMPred对这17种NAC成员进行分析，结果（图2）表明，没有强烈的推荐模型，推测NAC是通过核孔复合体进入细胞核的，并不像膜结合蛋白质那样，通过一些跨膜结构域固定在细胞膜上或细胞器膜上。

3.1.4 卷曲螺旋预测 利用在线分析工具COILS对17种NAC成员进行分析，结果（图3）表明，这些成员都没有太多的卷曲螺旋，只在150～200氨基酸残基位置出现少量的卷曲螺旋，在这些转录因子的N段、C段都有极少量的卷曲存在。卷曲螺旋是一种无规则结构，在蛋白质中起固定作用，即稳定已形成的转录因子复合物。150～200区段虽然不在保守区范围内，但在长久的进化过程中，这种结构却相当保守，这段无规则卷曲的存在对于NAC发挥其作用是必需的。

3.1.5 亚细胞定位预测 利用在线工具WOLF PSORT分别对17种NAC成员蛋白质的亚细胞定位进行分析，结果表明，它们都定位于细胞核，这也从侧面表明了这些转录因子的存在及其发挥功能的场所是细胞核。

3.2 蛋白质二级结构的预测和分析

二级结构指蛋白质多肽链本身的折叠和盘绕的方式。二级结构主要有-螺旋、β-折叠、β-转角、无规则卷曲。采用GOR4分析17种NAC家族成员的二级结构，结果表明，这17种NAC家族成员在二级结构上也具有很高的相似性。如图4所示，列出的这3种成员的二级结构预测结果显示在0～50、150～250氨基酸残基的位置上，一般出现-螺旋，100～150氨基酸残基的位置上则出现较多的β-折叠，其他位置则被无规则卷曲填充。总体来看，17种成员的二级结构有着较高的相似性，这从某种程度上反映了它们在三级结构上的相似性。

3.3 蛋白质三维结构分析与同源建模

蛋白质三级结构的预测和分析，对理解蛋白质结构和功能之间的关系有一定的作用。生物信息学的快速发展，使通过生物软件构建蛋白质的结构得以实现。利用CPHmodels对17种NAC家族成员进行同源建模，并用RasMol-Raindy将结果进行处理（图5）。结果表明，17种成员在三级结构上表现出了非常高的相似性，基本上都是几个螺旋元件包围着一个扭曲的β-折叠片，推测它们是以这种结构结合DNA，进而发挥作用。另外，在这些结构群之外都有一段较长的无规则卷曲，推测这个小尾巴的功能是在转录因子NAC结合顺式作用元件时的稳定结合体。

3.4 NAC蛋白质家族系统进化树的构建

根据蛋白质的序列或结构差异关系可构建分子进化树或种系发生树。采用MEGA 4.1中的Neighbor-Joining算法，自检举1 000次，构建了17种成员的进化树（图6），这17种成员主要分为4个类群，最早在0.4水平形成两个分支，一支是类群Ⅳ，另一支在0.3水平形成明显的3个新的分支，它们是类群Ⅰ、类群Ⅱ、类群Ⅲ。总的来说，这些NAC家族成员在0.4水平才出现分支，说明它们的亲缘关系相近。

3.5 相似性比对分析及保守区的获得

利用在线程序ClustalW2进行序列比对，找到了NAC家族中的保守区段。如图7所示，能明显看出N端的5段保守区。这5段保守区对应的二级结构可以根据对应的氨基酸残基顺序，从二级结构预测中找到对应的结构。在此基础上可以设计出这类抗逆性相关的NAC成员的保守区引物（图8）。利用该引物可进一步克隆到NAC基因的保守区，再通过RACE技术就能进一步获得NAC全长基因，为未鉴定过的植物获得NAC基因奠定了基础。

4 小结

近年来的研究表明，多达几十种植物中的NAC转录因子被发现，并对其空间结构和生物学功能的研究进行了探讨，但是由于种类的多样性和生物功能的复杂性，还未能明确阐明不同的NAC转录因子其空间结构与调控机制之间的关系，因此通过多种生物信息学方法，对与抗逆性相关的NAC转录因子成员进行多角度的分析，为其高效利用提供参考，也为植物在抗逆性方面的遗传改良奠定理论基础。

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