PD—1/PD—Ls与免疫相关疾病的研究进展

[摘要] PD-1是CD28分子家族的成员之一，表达于多种免疫细胞表面，通过PD-L1或PD-L2表达负性调控信号。PD-1的免疫受体络氨酸转化基序（ITSM）磷酸化后可以募集SHP2降低PLCg2，PI3K，VAV和ERK1/2的激活，进而调控免疫细胞的激活和免疫耐受。PD-1与其配体的相互作用在自身免疫性疾病，感染性疾病和肿瘤等方面均起重要作用。PD-1与其配体的生理学作用表明调控PD-1途径是治疗人类多种疾病的一个靶向目标。本文总结了PD-1与其配体的免疫调控功能以及在相关性疾病中的临床意义。

[关键词] PD-1；PD-Ls；免疫功能

[中图分类号] R392 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）10（c）-0031-04

程序性坏死分子1（programmed death-1，PD-1）作为CD28家族分子之一，属于免疫细胞的抑制性共刺激分子，对免疫细胞的功能具有重要的负性调控作用。最初的研究表明，PD-1和其配体是通过抑制T细胞的活化和增殖导致免疫耐受。目前多种免疫相关性疾病研究发现，PD-1和PD-L1、2相互作用不仅对诱导和维持免疫耐受以及避免自身免疫性损害具有重要的作用；而且可以降低感染和肿瘤的免疫反应，进而导致慢性感染和肿瘤。更重要的是，临床研究发现，调控PD-1途径可能是治疗肿瘤、感染等免疫相关性疾病的一个新的靶点。

1 PD-1和其配体的发现与结构

1992年，Ishida等[1]首先发现PD-1是一种诱导细胞凋亡的分子。PD-1最初是在研究差异杂交时被发现的；它能导致造血干细胞系和杂交瘤T细胞发生细胞凋亡，并且这两种细胞系的凋亡需要RNA的重组和蛋白的合成。通过对死亡的造血干细胞和杂交瘤T细胞cDNA和mRNA的克隆和分析发现它们都可以编码PD-1互补DNA。通过对PD-1核苷酸序列分析推断PD-1是一种属于膜蛋白Ⅰ类分子，并且在细胞外结构域上有一个IgV的的区域。然而，研究发现PD-1的cDNA在造血干细胞系和杂交瘤T细胞系的表达增加并不能诱导细胞凋亡，而且PD-1的功能仍不明确。在PD-1基因敲除的小鼠自发性狼疮性关节炎和血管球性肾炎中发现PD-1对免疫反应起到负性调控的作用。Freeman等[2]通过数据分析发现B7类似的分子，通过生理学和功能学试验，B7类似分子被认为是PD-1的配体并且取名为PD-L1，随后命名为CD274；进一步研究发现PD-L2，命名为CD273。

PD-1属于Ⅰ型膜糖蛋白，它的组成包括IgV结构域，并且与CTLA-4，CD28和共刺激分子拥有21%～33%的相同序列。CTLA-4形成了同型二聚体，而PD-1由于缺乏膜近端的半胱氨酸残基，因此它需要CD28分子家族的其他同型二聚体，并且它是以单体的形式存在于细胞表面。PD-1的细胞质结构域有两个络氨酸残基组成，其中一个为免疫受体络氨酸抑制基序（ITIM），另一个组成免疫受体络氨酸转化基序（ITSM），它们是PD-1发挥免疫抑制功能所必需的两个受体[3]。PD-Ls也属于Ⅰ型膜糖蛋白，由IgC和IgV两个结构域组成。PD-L1和PD-L2的氨基酸序列重叠性达40%，而PD-Ls与B7s的氨基酸序列重叠性约20%。然而，PD-L1如何表达抑制性信号的机制尚不明确。

2 PD-1的表达调控

PD-1表达于CD4和CD8T细胞、B细胞、单核细胞、NK细胞和树突状细胞（DCs）。研究表明PD-1在T细胞受到刺激后数小时内可表达于激活的T细胞表面，而静止期的T细胞不表达PD-1。对于PD-1配体来讲，PD-L1和PD-L2也有不同的表达。PD-L1持续表达于T细胞和B细胞，DCs，巨噬细胞，间充质干细胞和骨髓源性的细胞。此外，PD-L1还可广泛表达于非造血细胞表面，包括肺，血管内皮细胞，肝脏非实质细胞，间充质干细胞、胰腺细胞等。相反，PD-L2仅表达于活化的树突状细胞，巨噬细胞，骨髓源性细胞和超过50%以上的腹膜B细胞[4]。对比研究表明，PD-L1和PD-L2敲除的小鼠与抗PD-L1和PD-L2的抗体均可抑制抗原递呈细胞的功能并且两种配体在组织上有不同的功能特性[5]。

T细胞或B细胞受体介导的信号反应可以诱导PD-1的表达，并且肿瘤坏死因子可以使PD-1表达扩增。特别是在慢性感染中，PD-1在CD8T细胞表面的表达依赖于抗原决定族的识别[6]。然而，PD-1表达调控的机制依然不清楚，但是PD-1的上调与IFN-α，IFN-β和IFN-γ相关。IL-4和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子可诱导PD-L2在树突状细胞表面表达，IL-10可以诱导PD-L1在单核细胞表面表达。

3 PD-1信号抑制作用的分子机制

PD-1的抑制机制首先在B细胞系进行研究。PD-1的ITIM和ITSM中的α-氨基对羟苯丙酸残基通过Lyn磷酸化进而上调BCR与FcPD的交叉偶联，并且磷酸化的ITSM而非ITIM的α-氨基对羟苯丙酸残基通过SH2的区域募集SHP-2。而SHP-2使BCR近端信号分子包括Iga/b和Syk去磷酸化，Iga/b和Syk可以减弱下游分子PLCg2，PI3K，vav和ERK1/2的激活[7]。另外，有报道称PD-1抑制TCR信号是通过相似的通路。研究表明在T细胞表面ITSM的磷酸化通过募集SHP-1和SHP-2发挥作用。SHP-1与PD-1磷酸化的ITSM结合，其抑制功能较SHP-2明显减弱。ITSM首先被定义为CD150具有双重功能。

PD-1信号已经证实在诱导免疫耐受和调节性T细胞形成过程中起重要的作用。最近，Francisco等[8]研究表明PD-1的增加首先诱导调节性T细胞的形成。此外，PD-1的信号维持FoxP3的表达并且增加他们发挥抑制信号的有效性。PD-1诱导的调节性T细胞表达磷酸化的Akt，mTOR，S6和ERK2的能力降低，同时PTEN表达升高，提示PD-1信号通过中和Akt-mTOR来促进调节性T细胞的增殖。

4 PD-1的生物学意义

4.1 PD-1在自身免疫性疾病中的作用

PD-1在自身免疫性疾病中起作用是通过PD-1基因敲除小鼠的自身免疫疾病研究中首次被证实。PD-1的缺失导致自身迟发型红斑狼疮疾病的发展伴随IgG3在肾小球沉积以及由于自身抗体对肌钙蛋白Ⅰ的作用导致的扩张型心肌病。自身免疫性疾病的动物研究模型进一步强调PD-1及其配体对免疫调节功能的重要性。非肥胖型糖尿病动物模型中发现，PD-1在胰岛细胞表面表达升高。在非肥胖型糖尿病动物中注入PD-1抗体或PD-L1抗体可以加速糖尿病的形成，并且与胰岛炎和T细胞的促炎因子的产生相关[9]。单纯阻断CTLA-4仅能加速新生儿糖尿病的发展。而阻断PD-1/PD-L1可以加速年幼和年长糖尿病大鼠的发展过程。在自身脑脊髓炎（EAE）模型中，PD-1和其配体同样可以抑制EAE。PD-1通过增加IFN-γ诱导的髓鞘少突胶质糖蛋白（MOG）以及MOG特异性抗体加重EAE的发展过程。

PD-1参与人类自身免疫性疾病已经成为事实。研究表明，PD-1基因与系统性红斑狼疮的形成存在紧密的联系。PD-1与多种自身免疫性疾病相关，包括Ⅰ型糖尿病，多发性硬化症，类风湿性关节炎，Graves病和强制性脊柱炎[10]。一些人类自身免疫性疾病研究表明PD-1和其配体具有重要的调节功能。多发性硬化症患者使用IFN-β治疗6个月后体内的PD-L1 mRNA较未治疗前增加8倍以上，提示IFN-β的抗炎反应促进PD-L1表达。PD-L1的自身抗体已经在类风湿性关节炎患者体内已经被证实与疾病的发展相关，并且该抗体能够阻断PD-1-PD-L的抑制，进而阻断自身免疫性疾病的发展过程。

鉴于PD-1-PD-L通路在自身免疫中的重要性，通过增加PD-L的表达或控制PD-1对于改善自身免疫性疾病提供了一种新的靶向治疗。进一步研究通过控制PD-1-PD-L途径可以评估治疗自身免疫性疾病的治疗策略。

4.2 PD-1与慢性病毒感染

在慢性病毒感染期，病毒特异性CD8T细胞表现为对抗原的无反应性和无功能性的消耗状态。这些不断消耗的CD8T细胞的共同特性表现为不断丢失细胞毒性和分泌IL-2、TNF-α及IFN-γ的能力。在大鼠淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）模型中一个特征是CD8T细胞的消耗，这种损害也存在于在人类HIV、HBV、HCV等病毒感染性疾病中[11]。他们首先证实在LCMV模型中PD-1高表达与消耗性CD8T细胞的关系，并且PD-1-PD-L途径对调节性T细胞的耗竭起重要的作用。在急性LCMV感染后PD-1短暂性的在CD8T细胞膜上表达后迅速下调。在慢性LCMV感染中，淋巴组织或非淋巴组织中CD8T细胞膜上的PD-1持续性高表达。在慢性病毒感染性疾病中，PD-1在每个细胞表达的水平对于调控T细胞的功能是非常重要的。HIV特异性CD8T细胞表达PD-1的比例与病毒负荷及其增殖能力的降低相关[12]。慢性HCV感染异性CD8T细胞也表现为T细胞增殖和分泌能力的下降，这种变化与PD-1的表达相关。因此，PD-1可以作为病毒特异性CD8T细胞的标识，代表T细胞的消耗水平和疾病严重性。

在慢性病毒性感染中PD-1-PD-L途径对CD8T细胞的作用是调控其对病毒杀伤作用。在小鼠实验中，用PD-L1抗体阻断PD-1途径可以使细胞因子的产量增加，促进LCMV特异性T细胞的增殖，更重要的是可以降低病毒负荷。在灵长类动物猴免疫缺陷病毒感染试验中，使用PD-1抗体阻断PD-1途径可促进病毒特异性CD8T细胞增殖和分泌功能，同时降低血清中病毒的含量[13]。研究表明，用单克隆抗体阻断PD-L1后可促进HIV特异性T细胞增殖及TNF-α、IFN-γ和丝氨酸蛋白酶增加[12]。然而，阻断或限制PD-1或其配体也可导致自身免疫性疾病，进一步研究需要寻找有效的方法控制这条途径激活病毒特异性T细胞同时降低导致免疫性疾病的风险。

4.3 PD-1抗肿瘤免疫的作用

越来越多的证据表明肿瘤的免疫逃避依赖于PD-1介导的免疫抑制完成的。PD-L1和PD-L2已经证实在多种实质性肿瘤和血液病中表达。而且，PD-Ls在肿瘤细胞的表达与肿瘤的预后有很强的相关性，这已经在多种肿瘤中得到证实，这些肿瘤包括肾细胞癌、卵巢癌、食管癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌和恶性黑色素瘤。Thompson等[14]研究表明PD-L1在肾细胞癌表达，肾细胞癌死亡患者体内淋巴细胞表面PD-L1的水平约为非死亡患者的4.5倍。Hamanishi等[5]研究发现PD-L1和PD-L2均阳性的肿瘤患者较其均阴性的肿瘤患者有更低的存活率。

目前，很多研究报道肿瘤细胞表面的PD-Ls可抑制抗肿瘤免疫，它是通过抑制T细胞的激活和肿瘤细胞的坏死或诱导肿瘤特异性T细胞的凋亡来发挥作用。树突状细胞表面的PD-Ls也可以抑制T细胞的激活。同时，很多实验证实阻断PD-1在抑制肿瘤发展中的作用。阻断方法包括抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体，PD-1基因敲出，RNA干预等。抗人类PD-1单克隆抗体已经进行了Ⅰ期临床试验，39例患者包括非小细胞肺癌、肾细胞癌、结肠癌、恶性黑色素瘤和前列腺癌49。其中1例结肠癌患者对该抗体完全有效，2例肾细胞癌患者对该抗体部分有效[15]。此外，抗人类PD-L1抗体也进行了多中心的Ⅰ期临床试验，参与这项研究的207例患者包括75例非小细胞肺癌患者，55例恶性黑色素瘤，18例结肠癌患者，17例肾细胞癌患者，17例卵巢癌患者，14例胰腺癌患者，7例胃癌患者和4例乳腺癌患者。治疗过程中出现3级或4级毒性反应的患者约为9%。同时，14例黑色素瘤患者，6例非小细胞肺癌患者，3例卵巢癌患者和7例肾细胞癌患者病情稳定持续了至少24周[16]。抗PD-L1抗体在诱导肿瘤持续性坏死和促进疾病稳定性发展方面具有重要的作用。这些研究表明无论是阻断PD-1、PD-L1还是阻断PD-1-PD-L1途径对于肿瘤的治疗都是一个重要的靶点。

5 小结与展望

自1992年PD-1被发现以来，PD-1与其配体首先在调控T细胞激活和免疫耐受方面证实发挥着重要的作用。随后发现，PD-1途径在自身免疫，感染免疫和肿瘤免疫等方面均起关键性作用。鉴于PD-1的重要生物学作用，控制PD-1途径可能会给复杂性疾病的治疗提供方法。事实上，很多实验都尝试不仅通过PD-1抗体治疗癌症和感染性疾病；而且通过激活PD-1治疗自身免疫性疾病和移植反应。然而，PD-1与其配体的表达调控和信号转导的分子机制依然不明确。因此，未来的研究需要进一步明确PD-1途径的调控机制，这样不仅可以理解PD-1如何调控T细胞反应，而且可以有效控制PD-1途径，达到治疗疾病的目的。

[参考文献]

[1] Ishida Y，Agata Y，Shibahara K， et al. Induced expression of PD-1， a novel member of the immunoglobulin gene superfamily， upon programmed cell death [J]. EMBO J，1992，11（11）：3887-3895.

[2] Freeman GJ，Long AJ，Iwai Y， et al. Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation [J]. J Exp Med，2000，192（7）：1027-1034.

[3] Sidorenko SP，Clark EA. The dual-function CD150 receptor subfamily： the viral attraction[J]. Nat Immunol，2003，4（1）：19-24.

[4] Moll M，Kuylenstierna C，Gonzalez VD， et al. Severe functional impairment and elevated PD-1 expression in CD1d-restricted NKT cells retained during chronic HIV-1 infection [J]. Eur J Immunol，2009，39（3）：902-911.

[5] Hamanishi J，Mandai M，Iwasaki M，et al， Programmed cell death 1 ligand 1 and tumor-infiltrating CD8+ T lymphocytes are prognostic factors of human ovarian cancer[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（9）：3360-3365.

[6] Blattman JN，Wherry EJ，Ha SJ， et al. Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection [J]. J Virol，2009，83（9）：4386-4394.

[7] Chemnitz JM，Parry RV，Nichols KE， et al. SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation， but only receptor ligation prevents T cell activation [J]. J Immunol，2004，173（2）：945-954.

[8] Francisco LM，Salinas VH，Brown KE，et al. PD-L1 regulates the development， maintenance， and function of induced regulatory T cells [J]. J Exp Med，2009，206（13）：3015-3029.

[9] Ansari MJ，Salama AD，Chitnis T， et al. The programmed death-1 （PD-1） pathway regulates autoimmune diabetes in nonobese diabetic （NOD） mice [J]. J Exp Med，2003，198（1）：63-69.

[10] Okazaki T，Honjo T. PD-1 and PD-1 ligands： from discovery to clinical application[J]. Int Immunol，2007，19（7）：813-824.

[11] Klenerman P，Hill A. T cells and viral persistence： lessons from diverse infections[J]. Nat Immunol，2005，6（9）：873-879.

[12] Day CL，Kaufmann DE，Kiepiela P， et al.， PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression [J]. Nature，2006，443（7109）：350-354.

[13] Velu V，Titanji K，Zhu B， et al. Enhancing SIV-specific immunity in vivo by PD-1 blockade [J]. Nature，2009，458（7235）：206-210.

[14] Thompson RH，Gillett MD，Cheville JC， et al. Costimulatory B7-H1 in renal cell carcinoma patients： Indicator of tumor aggressiveness and potential therapeutic target[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（49）：17174-17179.

[15] Brahmer JR，Drake CG，Wollner I， et al. Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 （MDX-1106） in refractory solid tumors： safety， clinical activity， pharmacodynamics， and immunologic correlates [J]. J Clin Oncol，2010，28（19）：3167-3675.

[16] Brahmer JR，Tykodi SS，Chow LQ， et al. Safety and activity of anti-PD-L1 antibody in patients with advanced cancer [J]. N Engl J Med，2012，366（26）：2455-2465.

（收稿日期：2013-05-28 本文编辑：卫 轲）