重组腺病毒Ad―GFP―C197的构建及其抗肿瘤活性研究

摘要：端粒酶是维持端粒长度的重要组成部分，是肿瘤发生的标志物之一。构建了能表达人端粒酶逆转录酶（hTERT）C端936-1132氨基酸片段（C197）的重组腺病毒Ad-GFP-C197，并观察其对Hela细胞增殖的影响。结果显示，Ad-GFP-C197感染Hela细胞后，采用免疫印迹法检测到C197在细胞内得到高效表达。此外，Ad-GFP-C197明显抑制Hela细胞的增殖，诱导细胞凋亡，并且降低Hela细胞中端粒酶活性。上述研究为进一步研究hTERT C末端功能打下基础，并为肿瘤的生物治疗提供新的思路。

关键词：重组腺病毒；Hela细胞；人端粒酶逆转录酶；C197；细胞凋亡；端粒酶活性

中图分类号：R966 文献标识码：A 文章编号：1007-7847（2015）03-0237-05

端粒是在染色体末端维持染色体稳定的帽状结构，含有特征性的TTAGGG重复片段。细胞每一次分裂均会使TTAGGG片段的丢失，最终导致DNA缺损，引起细胞死亡。端粒酶是一种核糖白，能特异性地在染色体DNA末端加上TTAGGG片段，防止端粒缩短。绝大多数人体细胞中检测不到端粒酶的活性[1]。与此相反，在85 010的肿瘤细胞中检测到了端粒酶活性[2]。端粒酶对肿瘤的发生发展起到重要的促进作用[3]。

人端粒酶主要组成部分包括RNA（ humantolemerase RNA，hTR）和逆转录酶（human telom-erase reverse transcriptase，hTERT）。hTR作为模板，在hTERT的作用下使端粒末端得以延长。hTERT有3个结构域，分别是N末端部分，具有逆转录活性的中间部分（逆转录区），以及一小段C末端序列[4]。N末端主要是与hTR结合部位，C末端主要是与DNA结合部位，这两部分是hTERT与其他逆转录酶的主要区别。逆转录区是催化活性部位，几乎所有的逆转录酶在该区的活性基团都高度保守。目前对hTERT不同片段的研究较多的是将hTERT的N末端和逆转录区的保守基因进行缺失突变或识别hTERT自然存在的不同mRNA剪切体，观察这些突变体或剪切体对肿瘤细胞增殖的影响和端粒酶活性[5-7]。另外，一些剪切体可以翻译成蛋白质，表现出不同的生理和病理功能，如抑制细胞增殖、抑制Wnt信号途径等端粒外功能[8，9]。

目前对hTERT C末端的研究较少，有研究表明，hTERT的C末端可调节hTERT在细胞内定位[10]，对端粒酶的功能不可或缺[11]。在前期的研究中，我们曾经构建了表达hTERT C末端197个氨基酸（hTERT 936-1132，C197）的真核表达质粒[12]，但表达量不高。在此基础上，本研究构建了能大量表达C197片段的重组腺病毒Ad-GFP-C197.为进一步研究hTERT的C末端功能打下基础。同时还发现，过表达C197可明显抑制Hela细胞增殖，促进其凋亡，降低细胞端粒酶的活性，为肿瘤的生物治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1材料1

.1.1 菌种、细胞系、载体

BJ5183、DH5α、HEK293细胞、Hela细胞、重组腺病毒系统AdFJasy-l（包含骨架质粒PAdEasy-l和穿梭质粒PAdTrack-CMV）均由本实验室保存。

1.1.2 实验试剂和设备

胎牛血清、高糖培养基购自美国Hyclone公司；SalI和Ecor V限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Ex -Tag酶、Pme I酶、PacI酶均购自美国Thermo公司；小量质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自美国OMEGA公司；Trizol试剂盒购自上海生物技术有限公司；台盼兰试剂盒购自碧云天公司；凋亡检测试剂盒购自美国BD公司；PVDF膜、TRAP法端粒酶活性检测试剂盒均购自美国Millipore公司；ECL显色试剂盒购自美国Thermo公司；EB溶液购自美国Sigma公司；6-his tag抗体、凝胶成像分析仪（美国Kodak公司）；GDPDH抗体、羊抗鼠IgG二抗均购自美国Santa公司；细胞恒温培养箱（美国Thermo公司）；高速离心机（美国Backman公司）；荧光倒置显微镜（日本Nikon公司）。

1.2方法

1.2.1 目的基因获取

根据GenBank公布的人hTERT基因序列，选取C端936-1132氨基序列片段（命名为C197），在该片段中的C端引入EcorV限制性酶切位点，在N端引入6个his标签和SalI限制性酶切位点，片段总长度为650 bp，合成后克隆至pGSI载体（上海生工公司合成）。

1.2.2 重组腺病毒大质粒的构建和鉴定

将含有目的基因的pGSI载体进行双酶切（Sal I和EcorV酶），酶切片段经琼脂糖凝胶电泳分离后，回收含有his tag的C197基因。穿梭质粒PAdTrack-CMV分别用SalI和EcorV限制性内切酶进行双酶切，随后在T4 DNA连接酶作用下与C197基因进行连接，获得重组质粒PAdTrack-C197。用Pme I酶线性化PAdTrack-C197，将其转化进入到含有骨架质粒PAdEasy-l的BJ5183细菌中进行同源重组，得重组大质粒PAd-C197。以重组大质粒PAd-C197为模板，C197基因的上下游引物（上游引物序列：5'-AGGGTCGACACCAT-GCATCATCACCATCACCAT-3'，下游引物序列：5'-TGGATATCTCAGTCCAGGATGGTCTTGAA -3'）进行PCR扩增鉴定和基因序列测序，同时用SalI和EcorV限制性内切酶对质粒进行双酶切鉴定。

1.2.3 重组腺病毒Ad-GFP-C197的包装

将重组大质粒PAd -C197进行Pac I线性化，用脂质体2000将线性化产物转染进入HEK293细胞中进行腺病毒包装，待细胞出现CPE病变现象时，收集细胞，反复冻融3次，离心（3 000 r/min，4 0C）收集上清，得到病毒原液Ad-GFP-C197。空载体对照病毒Ad-GFP按照同样的方法进行包装。

1.2.4重组腺病毒的纯化及滴度测定

Ad-GFP-C197和Ad-GFP在HEK293细胞中扩增后，氯化铯密度梯度离心法纯化病毒；最后转入透析袋，4 0C透析过夜[13]后分装保存，分别取一管用绿色荧光蛋白标记法[14]检测病毒滴度。

1.2.5 C197蛋白在Hela细胞中的表达

Hela细胞接种于6孔板（每孔2xl05个细胞），分别将Ad-GFP-C197和Ad-GFP （MOI=100）转染Hela细胞48 h，提取6孔板中细胞的总蛋白行免疫印迹实验。

1.2.6 Ad-GFP-C197对Hela细胞凋亡及增殖的影响

收集Ad-GFP-C197和Ad―GFP转染24 h、48 h和72 h的Hela细胞，按照Annexin V-PE凋亡试剂盒说明书处理样品后上流式细胞仪进行检测并收集数据，根据早期凋亡细胞占活细胞数的比例来计算凋亡率并进行统计；同时将Hela细胞铺于24孔板中（每孔lxl04个），共7块板，每组实验6个复孔。用Ad-GFP-C197和Ad-GFP分别感染各组细胞，每天取1块板进行实验，用胰酶消化各组细胞，采用台盼兰计数法对活细胞进行计数，并绘制细胞增殖曲线图。

1.2.7 TRAP法检测Hela细胞的端粒酶活性

收集Ad-GFP-C197转染24 h、48 h和72 h后的Hela细胞，Ad-GFP转染72 h的Hela细胞以及正常的Hela细胞。分别提取总蛋白并调成一致浓度，按照TRAPEZE⑩Telomerase Detection Kit说明书操作；产物行12.50/0聚丙烯酰胺凝胶电泳后用EB溶液染色，于凝胶成像系统下拍照。

1.2.8 统计方法

均采用GraphPad Prism 5统计作图软件进行统计学分析。结果均以x+s表示。组间比较采用方差分析，以P

2 结果

2.1获得目的基因

从含有目的基因C197的pGSI质粒中，用SalI和EcorV酶进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳可见650 bp特异性条带，大小与目的基因相符。结果见图l。

2.2 PAd-C197大质粒的鉴定

以大质粒PAd-C197为模板，C197基因的上下游引物进行PCR，且将PAd-C197大质粒进行SalI和EcorV双酶切，均得到目的条带（650 bp），测序结果显示该片段序列与我们预计的序列一致，表明重组大质粒PAd-C197构建正确，结果见图2。

2.3重组腺病毒包装及扩增

PacI酶切线性化的重组大质粒PAd-C197转染至HEK293细胞，l周后镜下可见细胞呈彗星状绿色荧光，见图3；表明重组大质粒在细胞内得到表达，可视为重组腺病毒包装成功。

2.4病毒滴度的测定

Ad-GFP-C197和Ad-GFP经扩增纯化后，采用绿色荧光蛋白法进行病毒滴度测定，结果显示Ad-GFP-C197的滴度为3.14xl011 pfu/mL，对照病毒Ad-GFP的滴度为2.34xl011 pfu/mL。

2.5 C197在Hela细胞内的表达

Ad-GFP-C197转染Hela细胞48 h后，和空载体病毒Ad-GFP组相比，Ad-GFP-C197组的C197蛋白成功表达，进一步说明了重组腺病毒Ad-GFP-C197构建成功。结果见图4。

2.6 Hela细胞凋亡和增殖情况

与Ad-GFP组比较，Ad-GFP―C197转染Hela细胞后，在第3d开始出现增殖抑制作用，细胞增殖速率明显降低；在转染后24 h、48 h、72 h，Ad-GFP-C197转染的Hela细胞的凋亡率明显高于Ad-GFP对照组，表明Ad-GFP-C197能明显地抑制Hela细胞增殖并诱导Hela细胞凋亡。结果见图5。

2.7 TRAP法检测Hela细胞的端粒酶活性

依据TRAP方法检测端粒酶活性，结果显示，每一组都出现了36 bp的条带，说明TRAP方法操作成功，阴性对照组无端粒酶活性。与端粒酶阳性对照组和空白对照组相比，Ad-GFP转染组的端粒酶活性不受影响，而Ad-GFP-C197转染组的端粒酶活性在第2d开始出现降低，第3d降低得更明显。说明Ad-GFP-C197能够明显地抑制Hela细胞中端粒酶活性。结果见图6。

3讨论

端粒酶在除造血组织和生殖细胞外的正常组织中不表达或低表达，而在80%―90%的肿瘤中表达异常增高，所以端粒酶的激活可能是肿瘤发生过程中的关键因素。而端粒酶逆转录酶hTERT是端粒酶活性的限速酶，hTERT的表达异常增加也通常被认为是肿瘤发生前期标志[15～17]。已有研究表明在体外降低hTERT的表达，可以缩短端粒长度、诱导细胞凋亡以及抑制肿瘤细胞的生长，于是hTiFRT成为抗肿瘤研究中一个新的特异性靶点[18，19]。

hTERT是由N端（RNA结合区）、逆转录区（催化活性区）和C端3个功能区组成，近年来大部分研究都针对N端和逆转录区，而C端是调节hTERT在细胞内定位的重要结构域，也是其在细胞内进行端粒末端复制所必需的结构域[20]。但目前对于hTERT的C端研究不多。本研究构建的重组腺病毒Ad-GFP-C197能在细胞内高效表达hTERT C末端完整的197个氨基酸。在表达载体的设计上，我们在C197片段的N端加上了6个His标签，不但有利于检测C197的表达，而且便于后续的蛋白纯化，使得我们很方便就能得到足量的hTERT C末端片段，为进一步研究其功能打下基础。

PAdEasy一l腺病毒载体是一种El区和E3区双缺失的复制缺陷型载体，要得到感染性病毒则需要在含有El区的HEK293细胞内包装复制[21]该载体通过在细胞内复制可大大增加治疗基因的拷贝数，使治疗基因高水平表达[22]，而且该载体安全，不会整合到宿主细胞内，因此是应用于临床的一种基因治疗载体。如Ad-p53重组腺病毒注射液（今又生）应用于临床治疗肿瘤已数年，并取得了较好的疗效[23]。在实验中，我们发现将重组腺病毒Ad-GFP-C197感染Hela细胞后，能够明显诱导细胞凋亡并抑制其增殖，同时还能够降低端粒酶活性，显示Ad-GFP-C197可能具有作为肿瘤基因治疗手段的潜力，也为进一步的机制研究奠定基础。

端粒酶活性抑制能缩短端粒，但端粒酶活性抑制至端粒缩短到临界值至少需要20 d以上[24]。而Ad-GFP-C197感染Hela细胞后3d即出现明显抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，表明其作用机制可能不只是通过作用于端粒，还可能通过端粒外作用介导。已有的研究表明，NF-KB通路在肿瘤发生发展过程中起着重要的作用[25，26]。hTERT在细胞核中，可以结合到NF-KB通路靶基因的启动子上，增强其转录和表达，促进肿瘤的生长[27]。已知hTERT C端含有14-3-3蛋白的结合位点，而14-3-3在端粒酶的核定位中发挥重要作用[28]。C197为完整的hTERT C端序列，我们推测C197在细胞内大量表达后，可能结合了大部分的14―3-3，进而抑制细胞内hTERT的核定位，使得NF-KB通路的活性受到抑制，进而抑制Hela细胞的增殖。相关的研究工作正在开展之中。