免疫组织化学技术检测新生乳鼠颞下颌关节软骨基质与Ihh表达的实验研究

时间:2022-02-07 11:50:12

免疫组织化学技术检测新生乳鼠颞下颌关节软骨基质与Ihh表达的实验研究

【摘 要】目的:探讨颞下颌关节发育的分子生物学机制。方法:选取5只BAL B/C新生乳鼠,取头,常规固定、脱钙、脱水、包埋,采用免疫组织化学技术检测颞下颌关节CollagenⅡ(ColⅡ)、CollagenⅠ(ColⅠ)、Aggrecan和印度豪猪蛋白(Ihh)的表达。结果:颞下颌关节盘中,ColⅠ和ColⅡ表达阳性,Ihh表达强阳性,Aggrecan未见明显表达;髁状突软骨中,ColⅡ表达阳性,Aggrecan表达强阳性,Ihh和ColⅠ少量表达。结论:ColⅡ、ColⅠ、Aggrecan和Ihh正常表达,在颞下颌关节形成与发育过程中发挥重要的作用。

【关键词】 颞下颌关节;软骨基质;免疫组织化学技术;印度豪猪蛋白;小鼠

Experimental Study on the Temporomandibular Joint Cartilage Matrix and the Expression of Ihh in Newborn Rats by Immunohistochemical Technique

SHAO Xiang,CHEN Hou-huang,CHEN Da,MA Yu-huan,ZHENG Wen-wei,YE Hong-zhi,LI Xi-hai

【ABSTRACT】Objective:To investigate the molecular mechanism of the development of temporomandibular

joint.Methods:Heads of five BAL B/C newlyborn rats were taken,fixed,decalcified,dehydrated and embedded.Immunohistochemical technique was used to detect the expressions of CollagenⅡ(ColⅡ),CollagenⅠ

(ColⅠ),Aggrecan and Ihh.Results:In the temporomandibular joint disk,the expressions of ColⅠ and ColⅡ

were positive,the expression of Ihh was strongly positive and Aggrecan had no obvious expression;while in condylar cartilage,the expression of ColⅡ was positive,the expression of Aggrecan was strongly positive,and Ihh and ColⅠ had a little expression.Conclusion:ColⅡ,ColⅠ,Aggrecan and Ihh have normal expressions,playing an important role in the formation and development of the temporomandibular joint.

【Keywords】 temporomandibular joint;cartilage matrix;Immunohistochemical technique;Ihh;mouse

颞下颌关节(temporomandibular joint,TMJ)由下颌骨的下颌头关节面、颞骨的下颌窝和关节结节关节面、关节囊、关节腔,以及将关节腔分为上、下两部分的关节盘组成[1],多种因素参与影响颞下颌关节的生长发育[2-3],了解颞下颌关节的生长发育过程,对深入研究颌面部畸形的发病机制有着重要的临床意义。小鼠的颞下颌关节基本结构与人相似,但下颌骨升支端有髁状突、喙突与角突,其中只有髁状突参与构成颞下颌关节。目前,颞下颌关节的结构和功能已有系统的描述,但其发育相关的分子生物学机制有待深入研究[4-5]。因此,本研究以新生乳鼠颞下颌关节为研究对象,采用免疫组织化学技术,观察小鼠发育过程中颞下颌关节软骨基质与印度豪猪蛋白(Ihh)的表达变化,为揭示颞下颌关节发育机制提供新的

途径。

1 材料与方法

1.1 实验动物 BAL B/C新生乳鼠5只,上海斯莱克实验动物有限责任公司购买雌性孕鼠生产,动物合格证号:SCXK(沪)字第2012-0002号。实验室室温恒定(22±1)℃,湿度(56±5)%,紫外线定期消毒,自由摄食饮水,给予质量分数为0.3%的钠饮食。

1.2 试剂和仪器 磷酸盐缓冲液(PBS,pH = 7.4,美国Hyclone公司);Ihh(1∶200;ab39634)、ColⅡ(1∶200;ab53047)、ColⅠ(1∶500;ab34710)和蛋白聚糖(Aggrecan)(1∶500;ab36861)抗体(美国Abcam公司);枸橼酸盐缓冲液(pH = 6.0,美国Sigma公司);山羊血清,通用型二步法检测试剂盒(含质量分数为3%的过氧化氢去离子水和多聚辣根酶标记羊抗兔IgG即二抗)以及DAB显色试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司);光学显微镜(德国徕卡公司);石蜡切片机(德国徕卡公司);生物组织石蜡包埋机(孝感亚光医用电子技术有限公司)。

1.3 取 材 空气栓塞法处死新生乳鼠,立即放入PBS中,取下头部置于质量分数为4%的多聚甲醛4 ℃ 固定24 h,Kristense液脱钙1周,常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片备用。

1.4 免疫组织化学技术染色 室温下石蜡组织切片,二甲苯脱蜡,梯度乙醇脱水,将切片放入

10 mol・L-1枸橼酸盐缓冲液(pH = 6.0)的电炉锅内,锅内的水沸腾开始计时20 min,进行抗原修复,然后自然冷却到室温。山羊血清(1∶10)封闭非特异性染色,室温孵育15 min;然后分别加入一抗ColⅠ(1∶500)、ColⅡ(1∶200)、Aggrecan(1∶500)和Ihh(1∶200),PBS替代一抗作为阴性对照,4 ℃过夜;PBS洗涤后加入二抗(羊抗兔,1∶1000),37 ℃孵育20 min,再按试剂盒的说明书,ABC复合物处理,DAB显色,封片。光学显微镜下观察颞下颌关节免疫组化染色的

形态。

1.5 阳性细胞判断标准 颞下颌关节出现棕黄色颗粒为阳性细胞,观察蛋白的分布、阳性强度和阳性率。按染色强度打分:-为无色,+为浅黄色,++为棕黄色,+++为棕褐色,染色强度需与背景色相对比。

2 结 果

免疫组化染色结果定位明确,背景清晰,阳性颗粒清楚。ColⅡ在关节盘与髁状突软骨中均表达强阳性,Aggrecan特异性表达于髁状突软骨中,ColⅠ在关节盘中表达阳性但是髁状突软骨中仅见少量表达,Ihh在关节盘中表达强阳性、髁状突软骨表达明显较少。ColⅡ与Aggrecan的表达位置强弱基本一致,ColⅠ与Ihh的表达位置基本一致。见图1-图5。

3 讨 论

软骨基质主要由胶原纤维和蛋白多糖构成,具有缓解关节应力,维持关节周围组织拉伸性能的作用。ColⅠ和ColⅡ是颞下颌关节中最主要的胶原蛋白,它们通过聚集分子形成关节盘、髁状突以及关节窝。Aggrecan是最主要的蛋白多糖,以聚合体的形式存在,被包绕在胶原纤维间基质内,维持胶质网状结构充盈且具有高度弹性,也是软骨形成和骨骼发育的基本物质。蛋白聚糖与透明质酸结合形成复合物,游离于关节液中,形成高度的粘弹性,对关节软骨起着减震和等机械保护作用[6]。

在正常的生长发育过程中,髁状突的生长方式属于软骨内成骨,软骨内成骨始于增殖层内未分化的间充质细胞的增殖和分化,促进前体软骨细胞分化为软骨细胞,再逐渐成熟分化为前肥大软骨细胞和肥大软骨细胞,软骨基质由Ⅱ型胶原转变为X型

胶原,之后新生血管长入,肥大软骨细胞发生程序性死亡,部分矿化的软骨逐渐被骨替代。

Ihh是豪猪蛋白家族的一员,在颞下颌关节髁状突的发育过程中发挥重要作用,与髁状突生长、软骨的表型、软骨祖细胞的功能有关,同时是关节盘和关节腔形成的必要条件。胚胎发育早期,Ihh在颞下颌关节髁状突内已经有较强表达,Ihh受体及其效应基因Gli 1、Gli 2和Gli 3的表达范围已达髁状突外层的多形软骨细胞层和关节盘原基。在新生小鼠颞下颌关节的软骨和软骨膜中,Ihh基因显著表达[7],这与本实验的研究结果一致。Ihh基因敲除小鼠的髁突组织不能正常生长,结构紊乱,表现为细胞的增殖速率显著降低,具有增殖和分化功能的间充质细胞数量减少,软骨细胞的数量不足以维持髁突软骨的正常生长。同时,新生小鼠髁状突软骨内Ihh缺乏的同时伴随着ColⅠ、ColⅡ和Aggrecan表达改变,最终导致髁状突表面纤维软骨的特性改变[8]。

实验表明,ColⅡ和Aggrecan同时在髁状突软骨中高表达,ColⅠ主要在关节盘中表达,关节盘主要成分为纤维软骨,ColⅠ为纤维软骨所独有,可能是因为在颞下颌关节形成和发育过程中,ColⅠ

具有维持骨结构的完整及骨生物力学特性,而ColⅡ和Aggrecan则通过构成软骨基质,促进软骨细胞的分化,从而促进软骨的形成及骨骼发育。Ihh在新生乳鼠颞下颌关节的关节盘和髁状突中均有表达,可能因其在维持关节盘骨生物学特性、促进髁状突软骨发育中均发挥重要作用。本实验运用免疫组化染色法检测了乳鼠发育期颞下颌关节各部位Ihh、ColⅡ、ColⅠ和Aggrecan的表达变化,指标定位准确直观,且操作简便,实验费用低,具有同类实验其他方法所不具备的优势。

目前,影响颞下颌关节发育的因素尚未完全探明,如调控颞下颌关节组织间相互关系的信号分子的类型、关节盘形成过程对关节窝的影响等。未来的研究中,可以尝试运用实验胚胎学或者使用基因敲除小鼠模型进行研究,进一步阐明颞下颌关节发育的细胞和分子学机制。

4 参考文献

[1] Wang Y,Liu C,Rohr J,et al.Tissue interaction is required for glenoid fossa development during temporomandibular joint formation[J].Dev Dyn,2011,240(11):2466-2473.

[2] Li X,Liu H,Gu S,et al.Replacing Shox2 with human SHOX leads to congenital disc degeneration of the

temporomandibular joint in mice[J].Cell Tissue Res,2014,355(2):345-354.

[3] Li X,Liang W,Ye H,et al.Overexpression of Indian hedgehog partially rescues short stature homeobox 2-overexpression-associated congenital dysplasia of the temporomandibular joint in mice[J].Mol Med Rep,2015,12(3):4157-4164.

[4] Gu S,Wu W,Liu C,et al.BMPRIA mediated signaling is essential for temporomandibular joint development in mice[J].PLoS One,2014,9(8):e101000.

[5] Wu Y,Gong Z,Li J,et al.The pilot study of fibrin with temporomandibular joint derived synovial stem cells in repairing TMJ disc perforation[J].Biomed Res Int, 2014:454021.

[6] Aspberg A.The different roles of aggrecan interaction domains[J].J Histochem Cytochem,2012,60(12):987-996.

[7] Hinton RJ,Serrano M,So S.Differential gene expression in the perichondrium and cartilage of the neonatal mouse temporomandibular joint [J].Orthod Craniofac Res,2009,12(3):168-177.

[8] Li X,Liang W,Ye H,et al.Overexpression of Shox2 leads to congenital dysplasia of the temporomandibular joint in mice[J].Int J Mol Sci,2014,15(8):13135-13150.

收稿日期:2016-04-20;修回日期:2016-07-22

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