果MGAPDH同源基因的克隆及其表达分析

摘 要： 甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）是糖代谢和能量代谢过程中的关键酶。根据GAPDH基因保守序列设计PCR引物，利用RT-PCR和改良RACE技术，首次从果中分离克隆出MGAPDH同源基因的cDNA全长序列。该序列全长为1 356 bp，开放阅读框为1 203 bp，编码401个氨基酸。利用分子生物学软件对MGAPDH蛋白进行生物信息学分析，结果显示：MGAPDH蛋白分子量为42.8 ku，等电点为8.9；该蛋白包含2个功能域，即NADB_ Rossmann superfamily和Gp_dh_C superfamily；MGAPDH蛋白不含信号肽序列和跨膜结构，是非分泌蛋白， 位于叶绿体中。氨基酸序列进化分析结果显示，果MGAPDH蛋白可能与光合作用有关。半定量分析显示，果MGAPDH同源基因在果不同组织中均表达，并且表达水平差异不明显，说明果MGAPDH同源基因可作为果基因差异表达的内参基因。

关键词： 果； 甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）； 表达分析； 序列分析

中图分类号：S667．7 文献标识码：A 文章编号：1009－9980?穴2011?雪06－1019－06

Molecular cloning and expression analysis of a MGAPDH homologous gene from mango

LUO Cong1， HE Xin-hua1，2*， HU Ying1， TAN Chao1， OU Shi-jin1

（1College of Agriculture， Guangxi University， Nanning， 530004； 2Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology Lab， Nanning， 530007 China）

Abstract: Glyceral-dehyde-3-phosphate dehyrogenase (GAPDH） is a key enzyme in sugar metabolism and energy metabolism. PCR primers were designed by the conserved sequences of GAPDH gene，and a full-length cDNA sequence of MGAPDH homologous gene was firstly cloned from Mango by employing RT-PCR and modified RACE technique. The full-length cDNA is 1 356 bp and contains an ORF with 1 203 bp， corresponding to a deduced protein of 401 amino acids. The results of bioinformatics analysis showed that the estimated molecular weight and isoelectric point of the putative protein were 42.8 ku and 8.9. The protein had two conserved domains， named as NADB_ Rossmann superfamily and Gp_dh_C superfamily. Bioinformatics analysis also indicated that the protein of mango MGAPDH is a non-secreting protein without any signal peptide and transmembrane domain，MGAPDH gene was located in the chloroplast. The phylogenetic analysis based on the sequence of amino acids showed that MGAPDH protein may relative to photosynthesis. Semiquantitative analysis showed that the MGAPDH homologous gene expressed in all tissues of mango， no significant differences in expression levels were founded among the tested tissues; the result indicted that MGAPDH homologous gene may be used as an internal standard for differential gene expression analysis in mango.

Key words: Mango（Mangifera indica）； Glyceral-dehyde-3-phosphate dehyrogenase (GAPDH）； Expression analysis； Sequence analysis

甘油醛-3-磷酸脱氢酶 （Glyceral-dehyde-3-phosphate dehyrogenase GAPDH） 是维持生命活动最基本的酶之一，是糖代谢和能量代谢过程中的关键酶，广泛存在于所有原核和真核生物中，它是一种多功能蛋白。在哺乳动物中，它具有膜融合与膜转运活性、微管蛋白成束活性、磷酸化活性、核RNA输出活性、DNA修复活性和核膜融合活性等，并且它还参与细胞凋亡过程[1]。在植物中，GAPDH与糖酵解、光合作用和抗逆有关。目前报道，高等植物中存在2种不同类型的GAPDH，一类依赖于NAD+，存在于细胞质中，在糖酵解过程中起作用，是糖酵解和糖异生过程中的关键酶；另一类以NAPD（H）为辅酶，也可以NAD+为辅酶，存在于叶绿体，是参与卡尔文循环的关键酶，与植物光合作用有关[2-3]。此外，该酶在厌氧、热激、伤害、抗盐碱以及能量供应中可能发挥着重要作用，是一种重要的抗逆境胁迫基因[4-6]。有研究报道。GAPDH基因在机体不同组织和细胞中表达丰度高且相对稳定，可用作差异表达研究时的内参基因[4，7-8]。

果（Mangifera indica）是世界上重要的多年生经济林果，素有热带果王之称。目前尚未见有关于果GAPDH基因方面的研究报道，我们以四季（Chok Anand Mango）为材料，利用RT-PCR和改良RACE技术成功获得了果MGAPDH同源基因cDNA全长序列，并对其进行了生物信息学和表达模式分析，旨在为进一步利用生物技术和基因工程手段研究该基因在果中的功能以及为果其他基因差异表达的研究提供内参基因。

1 材料和方法

1.1 材料

采集广西大学农学院标本园8 a生四季的叶、花、茎和不同发育阶段的果实 （叶、花、茎采集时间为2010年8月22日），迅速置于-40 ℃冰箱保存。

1.2 菌株和试剂

PrimeScript逆转录酶、TdT、RNase H、pMD18-T vector、dCTP、dNTP购自宝生物工程（大连）有限公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、X-Gal、IPTG、氨苄青霉素（Amp）购自上海生工生物工程技术服务有限公司，Dream Taq酶购自Fermentas公司；大肠杆菌JM109菌株、DL 2 000 DNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司。所有引物均采用Primer5.0软件设计，委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列见表1。

1.3 RNA提取和cDNA第1链的合成

我们对肖洁凝等[9]提取果RNA的方法进行改良，利用改良的SDS法提取四季老叶、嫩叶、花、老茎、嫩茎和果实的RNA，利用紫外分光光度计和电泳检测其浓度和完整性。cDNA第1链的合成用PrimeScript逆转录酶，逆转录引物为AUP1，步骤按说明书进行。

1.4 果MGAPDH同源基因全长的克隆

根据GenBank上已有的GAPDH基因保守序列设计上游引物3MGAu1，用引物3MGAu1和3’端下游锚定引物3Side扩增cDNA，获得果MGAPDH同源基因的3’端序列。反应体系为25 μL：第1链产物1 μL， dNTP （10 mmol・L-1） 0.5 μL，上下游引物（10 μmol・L-1）各1 μL， DreamTap 0.14 μL， buffer 2.5 μL， 超纯水18.86 μL。扩增参数为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，36个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带，将目的条带连接到pMD18-T vector载体、转化大肠杆菌JM109感受态细胞。经PCR验证的阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

在获得果MGAPDH同源基因3’端序列的基础上，根据巢式PCR原理，设计两条下游巢式特异引物5MGApd1和5MGApd2。利用本课题组改良的5’端RACE技术扩增果MGAPDH同源基因的5’末端[10]。

1.5 果MGAPDH同源基因生物信息学分析

用GenBank Blast 在线软件分析果MGAPDH同源基因与其他植物GAPDH同源基因核苷酸序列同源性；用Bio XM进行氨基酸序列预测；用在线网站计算氨基酸的等电点和蛋白质大小（isoelectric.省略/）；利用Signal P分析蛋白的信号肽序列；利用TMHMM对蛋白质的跨膜结构进行预测；用NCBI网站中的 conserved domain architecture工具对氨基酸序列的结构域进行预测；用3D-JIGSAW对蛋白质的三级结构进行预测分析，用RasMol2.7进行三级结构显示；用Clusta1W程序将果MGAPDH同源基因推导的氨基酸序列与其他物种GAPDH同源基因氨基酸序列进行多重比较，然后用MEGA4.1软件，选择连接近邻算法NJ（Neighbour joining）构建系统进化树。

1.6 果MGAPDH同源基因的表达分析

提取果叶、花、茎和果实的RNA，逆转录成cDNA，用紫外分光光度计检测cDNA浓度，把cDNA稀释为200 ng・μL-1为模板。利用半定量方法检测果MGAPDH同源基因在四季不同组织器官中的表达情况。PCR反应体系与果MGAPDH同源基因3’端的反应体系相同。PCR扩增参数为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共32个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物在1.8%琼脂糖凝胶上电泳。

2 结果与分析

2.1 果MGAPDH同源基因全长的获得

以果叶cDNA为模板，用引物3MGAu1和3’端下游锚定引物3Side扩增cDNA获得长度约为800 bp的明亮条带，经测序比对确认，获得长为809 bp的果MGAPDH同源基因的3’端序列。在获得基因3’端序列的基础上，设计了2条巢式特异下游引物（5MGApd1和5MGApd2）用于扩增果MGAPDH同源基因的5’端，通过TdT加尾、巢式PCR和降落PCR技术获得长度约为700 bp的条带，经测序比对成功获得了697 bp的果GAPDH同源基因的5’末端。 将MGAPDH同源基因的3’端和5’端序列进行拼接，拼接后其长度为1 356 bp，命名为MGAPDH（GenBank登录号：HQ585994）。

2.2 果MGAPDH同源基因的生物信息学分析

利用Bio XM分子生物学软件对果MGAPDH同源基因的氨基酸序列进行推导，发现该基因完整开放阅读框为1 203 bp，编码401个氨基酸（图1），相对分子量为42.8 Ku，理论等电点（pI）为8.9。利用PSORT （psort.hgc.jp/）在线软件对果MGAPDH蛋白进行亚细胞定位分析，果MGAPDH蛋白被定位在叶绿体中。将果MGAPDH基因的氨基酸序列导入NCBI中的conserved domain architecture工具对氨基酸序列的结构域进行预测，通过搜索发现其包含2个保守的结构域，一个是NADB_ Rossmann superfamily， 另一个为Gp_dh_C superfamily（图版-A）。经Signal P 3.0软件分析发现果MGAPDH蛋白不含信号肽序列，为非分泌性蛋白；经过TMHMM软件预测显示果MGAPDH蛋白不存在跨膜结构；果MGAPDH蛋白的结构域、信号肽和跨膜结构的预测结果与毛竹[7]、怪柳[11]和木榄[12]的GAPDH蛋白预测结果一致。

2.3 果MGAPDH蛋白三级建模

用3D-JIGSAW分析软件对果MGAPDH蛋白的三级结构进行建模（图版-B）。深红色为α螺旋，黄色表示β折叠，淡蓝色表示转角（Turn），白色表示其他残基，建模结果表明，果MGAPDH蛋白具有12个α螺旋、18个β折叠和多个转角。

2.4 果MGAPDH同源基因氨基酸系统进化分析

将果MGAPDH同源基因序列和GenBank中其他物种GAPDH同源基因序列进行同源性比较发现，果MGAPDH同源基因的核苷酸序列与其它物种的GAPDH同源基因的核苷酸序列相似系数在74%~83%，其中与葡萄和毛果杨的相似系数最高，达83%。用不同物种GAPDH基因编码的氨基酸序列构建系统进化树（图2），可将不同物种编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因明显分成两类。第I类既有部分植物的GAPDH同源基因，也有动物GAPDH同源基因，植物和动物的GAPDH同源基因能聚为一类，说明GAPDH同源基因在进化过程中高度保守；第Ⅱ类全部为植物GAPDH同源基因。果MGAPDH同源基因被聚类到第Ⅱ类，与葡萄亲缘关系最近。

2.5 果MGAPDH同源基因的表达分析

采用半定量RT-PCR法对果MGAPDH同源基因进行器官特异性表达分析（图3），结果表明，果GAPDH同源基因在老叶、嫩叶、花（盛花期）、花（末花期）、老茎、 嫩茎、花后20 d果实、花后40 d果实和花后60 d果实组织中均表达，并且表达水平没有明显差异，说明果MGAPDH同源基因可以作为果其他基因差异表达相关研究的内参基因。

3 讨 论

甘油醛-3-磷酸脱氢酶存在于许多物种中，在高等植物中存在2种不同类型的甘油醛-3-磷酸脱氢酶。毛果杨有2个GAPDH同源基因，一个由338个氨基酸构成（XM_002318078），另一个由404个氨基酸构成（XM_002321029）；毛竹也有2个GAPDH同源基因，一个由337个氨基酸构成（GU356597）[7]，另一个由402个氨基酸构成（FP100252）。本研究结果显示，从果中只分离克隆到一个果MGAPDH基因，编码401个氨基酸。果MGAPDH同源基因与其他物种同源基因的核苷酸同源性分析显示，果MGAPDH同源基因与其他物种的GAPDH同源基因的核苷酸序列相似性在74%~83%，说明GAPDH同源基因在进化过程中相对保守。

试验结果显示，编码2种不同类型的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因明显分开聚类。对GAPDH同源基因编码的氨基酸进行统计分析，结果显示第I类中的GAPDH同源基因编码337个左右氨基酸；第Ⅱ类中的GAPDH同源基因编码400个左右氨基酸。毛竹[7]、怪柳[11]、高羊茅[13]、马铃薯、陆地棉GAPDH同源基因分别编码337、341、337、338、336个氨基酸，聚类到第I类中，亚细胞定位显示这些蛋白均位于细胞质中，说明聚类到第I类中的GAPDH同源基因可能存在于细胞质中，与糖酵解过程有关。木榄[12]、毛果杨、江南卷柏、烟草、蓖麻的GAPDH同源基因分别编码405、405、402、392、404个氨基酸，聚类到第Ⅱ类中，亚细胞定位显示这些蛋白均定位于叶绿体中，说明聚类到第Ⅱ类中的GAPDH同源基因可能存在于叶绿体中，与植物的光合作用过程有关。果MGAPDH基因编码401个氨基酸，聚在第Ⅱ类，亚细胞定位显示其被定位于叶绿体中，说明果MGAPDH基因所编码的蛋白可能参与卡尔文循环，与果的光合作用有关。

果MGAPDH同源基因半定量分析显示，其在不同组织器官中的表达水平差异不明显，因此果MGAPDH同源基因可以作为果其他基因差异表达相关研究的内参基因。（本文图版见封3）

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