金刷把中多糖含量测定方法的研究

【摘要】 目的：建立一种稳定、简便的金刷把多糖含量的测定方法。方法：采用蒽酮-硫酸法测定金刷把多糖中多糖的含量，于630 nm处测定。结果：用此方法测定用葡萄糖的标准曲线R2=0.9993，平均加样回收率97.6%。结论：方法线性关系良好、准确，适用于金刷把中多糖含量测定。

【关键词】 金刷把； 多糖； 含量测定； 蒽酮-硫酸法

【Abstract】 Objective： To establish a easy method for determination of polysaccharide from Lethariella zahlbruckneri. Method： The content of polysaccharide was determined by anthrone sulfuric acid method at 630 nm. Result： The linear relationship of this method was well and the average recovery was 97.6%. Conclusion： This method is accurate and can be used for quality control of polysaccharide in Lethariella zahlbruckneri.

【Key words】 Lethariella zahlbruckneri； Polysaccharide； Determination； Anthrone sulfuric acid method

金刷把为松萝科植物金丝刷Lethariella cladonioides （Nyl.） Krog的枝状体，苦，平；镇静，消炎，止痛。主治癫痫、精神分裂、神经衰弱、头目眩晕等症；主产于陕西、四川、安徽、、云南、河南等省，着生于海拔3000米以上枯木上。是陕西民间常用中草药[1]，临床应用广泛，历史悠久。

金刷把作为地衣类药材，含有地衣酸、地衣多糖及多种微量元素等。其中地衣多糖和异地衣多糖作为地衣菌丝细胞壁的主要成分是所有地衣都含有的化学成分[2]。从20世纪70年代以来对地衣多糖的抗肿瘤活性研究实验证明，绝大多数地衣种类中所含的地衣多糖均具有极高的抗癌活性，特别值得重视的是地衣多糖的抗癌机理，不是直接杀伤细胞来抑制癌细胞的病态增殖，而是通过增强宿主的免疫防御系统来发挥作用的[3-9]。它可以激活机体内的巨噬细胞，被激活的巨噬细胞不损伤健康细胞，只溶解、破裂或吞噬癌细胞。因而克服了在化疗中健康细胞受损的严重副作用，既所谓的“中间宿主免疫性”[10-11]。金刷把具有药物及食品保健的开发潜力，但以往由于缺乏质量标准，其临床应用受到很大限制，因此本实验建立了一种分光光度法测定金刷把多糖含量的测定方法，为制定金刷把药材标准和进一步开发利用提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器与试剂 AR1140型电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司），科伟恒温水浴锅（余姚长丰仪表厂）；双光束紫外分光光度计UV-2550型（日本岛津）；离心机Z200A型（德国Laboriechnik公司）；SHZ-3型循环水真空泵（河南省巩义市英峪仪器厂）；SB 3200 DT超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；乙醇、浓硫酸、蒽酮等均为分析纯；无水葡萄糖对照品（38075-200709）；药材采自陕西省宝鸡市太白山，由西安市药检所鉴定。

1.2 溶液制备

1.2.1 对照品溶液 精确称取于105 ℃干燥至恒重的无水葡萄对照品100 mg，置100 mL容量瓶中，以蒸馏水溶解并稀释至刻度，再精密吸取10 mL置100 mL量瓶中稀释至刻度，摇匀，即得标准品贮备液。

1.2.2 硫酸-蒽酮溶液的制备 精密称取蒽酮0.10 g，放入100 mL棕色容量瓶中，逐渐加入浓硫酸溶液至刻度，摇匀使溶解完全，冷却至室温备用，注意避光保存。

1.2.3 供试品溶液的制备 称取破碎后的金刷把1 g，放置于500 mL圆底烧瓶中，加50倍量水，置沸水浴中回流提取3次，每次提取1.5 h，趁热用布氏漏斗抽滤，合并滤液。滤液转移至250 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀；精密量取10 mL，加95%乙醇60 mL，摇匀，放置于4 ℃下静置24 h，离心，倾去上层液体，沉淀加水充分溶解并转移至25 mL容量瓶中，定容摇匀。精密量取2.5 mL置25 mL容量瓶中，定容摇匀作为待测溶液。

2 方法及结果

2.1 测定波长的选择 分别精确吸取2 mL葡萄糖对照品溶液和试品溶液分别置2只具塞试管中，并加入蒽酮-硫酸试剂6 mL，充分振摇后静置10 min，再放入冰水浴中冷却10 min，取出。另以未加葡萄糖的溶液为空白液，于400～700 nm波长范围扫描。测得对照品和样品的最大吸收波长均为630 nm，故选择630 nm波长测定。

2.2 硫酸用量的选择 精密吸取葡萄糖标准品溶液2 mL，分别置于具塞试管中，并加入蒽酮-硫酸试剂4.0、6.0、8.0 mL，充分振摇后静置10 min，再放入冰水浴中冷却10 min，取出。在分光光度仪上630 nm处测定吸光度值。结果表明：浓硫酸用量为6.0 mL时，反应即可完全，见表1。

2.3 标准曲线的制作 吸取葡萄糖标准品溶液0、0.2、0.4、0.6 、0.8、1.0 mL于具塞试管中，各准确加入蒸馏水1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0 mL，再加硫酸蒽酮试剂8 mL，摇匀后静置10 min，冰水浴中冷却10 min，取出。于630 nm处测定吸光度值。以吸光度（Y）对葡萄糖浓度（x）得出回归方程Y=0.9707x+0.0089，R2=0.9993。在范围20～100 μg/mL范围内与吸光度呈良好线性关系。

2.4 稳定性实验 精密吸取标准品及样品溶液各1 mL，照标准曲线制备项下方法，依法测定吸光度，自冰水浴中取出后，每隔0.5小时测定一次，连续3 h测定吸光度考察其稳定性，计算得RSD=1.98%，表明样品溶液至少在3 h内稳定性良好。

2.5 精密度实验 取对照品溶液1 mL，按供试品测定项下操作测吸光度，平行测定6份。计算得RSD=1.33%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.6 重复性实验 精密称取样品粉末6份，每份约1 g，按供试品测定项下操作测吸光度，考察操作方法的重现性，计算得RSD=0.75%（n=6）。

2.7 加样回收率实验 精密称取3份样品溶液0.4 mL置于具塞试管中，依次加入0.1 mg/mL的葡萄糖溶液0.36、0.30、0.24 mL，并加入蒸馏水使总体积为1 mL，每个梯度各3份，空白对照为蒸馏水1.0 mL。按供试品溶液制备项下方法制备溶液，依法测定吸光度，在标准曲线中读出含量，计算得平均加样回收率97.6%，RSD=1.44%。

2.8 样品含量测定 精密称取5份金刷把样品，每份1 g，按照“1.2.3”项下所述方法制备供试品溶液，吸取待测液各2 mL置于具塞试管中，按照“2.3”项下所述方法测定吸光度，由回归方程计算，结果见表2。最后计算样品中多糖的平均含量为37.98 mg/L。

3 讨论

多糖是由10个以上的单糖基通过苷键连接而成的极性大分子化合物，常用的提取方法有水浸提法、酸碱浸提法、酶法、盐析法，微波提取法等，而植物多糖提取，以水浸提法最为普遍。多糖提取之后，还有许多杂质要除去，一般利用多糖难溶于有机溶剂的特性，用乙醇或丙酮进行反复沉淀洗涤。因为首次对金刷把多糖进行研究，故选用最普遍简单的水提醇沉法制备金刷把多糖。下一步研究可针对浸提温度、时间、乙醇浓度、醇沉时间、醇沉次数等条件进行多糖制备工艺优化。

多糖检测方法也有很多，如苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、DNS法、地衣酚法、Feling滴定法、间接碘量滴定法等，本实验所用蒽酮-硫酸比色法是最常用的多糖测定方法之一，基本原理是多糖在浓硫酸的作用下，水解成单糖，然后脱水形成呋喃环结构的糠醛衍生物，糠醛衍生物可以和许多芳胺、酚类以及具有活性次甲基的化合物缩合生成有色的化合物，在一定范围内颜色深浅与糖浓度成正比，从而可比色测定其含量。该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等，所以用蒽酮-硫酸法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。在金刷把多糖初步研究中，用蒽酮-硫酸法可以一次测出多糖总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值。糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为630 nm，故在此波长下进行比色。本实验反应过程中颜色稳定，在波长630 nm处和一定浓度范围内，吸光度与样品中多糖含量成正比，符合朗伯-比尔定律。实验简便准确，而且通过精密度、稳定性、加样回收率等试验来验证了这一方法的准确可靠性。

在测定过程中，则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，不然会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与意酮试剂发生反应而增加了测定误差。同时在实验中发现蒽酮硫酸试剂一定要现用现配，一次配够量，配制时硫酸试剂要用同一批号，加入显色试剂后需充分摇匀，冰水冷却时间严格把握，否则操作过程中的这些差异均会影响测定结果。

多糖作为地衣类药材的主要成分之一，已被发现地衣多糖具有多种生物活性，如免疫促进、抗肿瘤等[11-13]。而目前对地衣多糖的研究还在不断深入，所以建立一种简便、快速、准确的多糖含量测定方法对于金刷把的质量评价和开发利用具有重要的意义。对金刷把多糖含量进行了初步研究后发现金刷把中总多糖含量为37.98%，金刷把中地衣多糖含量如此之高，可能跟其生长环境有关，地衣生长速度极其缓慢，在体内会产生积累大量具有生物活性的代谢产物，可以看出金刷把是一种非常有潜力的药物资源，在新型药物研究中具有广远前景和重要意义，有望被开发成为新型药物。本实验为金刷把进一步的质量研究和开发利用提供了方法和依据。

参考文献

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（收稿日期：2014-01-25） （本文编辑：蔡元元）