制备微藻油脂的转基因小球藻生长的影响因素分析

摘要：利用从加拿大引进的转基因小球藻（Chlorella vulgaris）制备微藻油脂，探讨影响小球藻生长的条件，如培养基pH、培养温度等，以期获得脂肪酸组成以C16和C18为主的藻株及培养条件。结果表明，将转基因小球藻接种在氮磷质量比为4∶3、pH 8.5的GM-SC培养基中，在28 ℃进行培养，最终可得到生产状况较好、生长速度较快的小球藻。

关键词：小球藻（Chlorella vulgaris）；微藻油脂；脂肪酸；转基因

中图分类号：TK6 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）08-1905-03

随着全世界石油资源日渐枯竭，人类面临着能源缺乏的危机，同时，人类环境保护意识日渐增强，已逐渐认识到以石油为燃料会造成严重的空气污染，危害人类的身体健康[1]。而且石油燃烧产生的CO2会导致温室效应，破坏地球的生态平衡[2]。研究表明，生物柴油是最具有发展前途的柴油机替代燃料，是最重要的清洁燃料之一[3]。生物柴油是指以水生植物油脂、动物油脂等为主要原料，在催化剂的作用下通过可再生的动植物油与低碳醇酯交换制成的一种性质与石化柴油非常相似的燃油[4]。生物柴油既可以单独作为燃料使用，也可以与石化柴油调和使用。混合燃料不但能够改善柴油机的排放特性[5]，还可以提高柴油的性。生物柴油作为可再生能源，可缓解人类社会对石油的依赖；对环境友好，大大降低柴油机对空气的污染；燃点高于石化柴油，处理、运输、使用和贮藏都变得更加安全和便利。自从1981年南非首次提出生物柴油这一概念后，世界各国都十分关注这种“绿色能源”。现在许多国家都已经开展了生物柴油的研制和生产[6]。

小球藻（Chlorella vulgaris）含有丰富的脂类，是制备生物柴油的重要原料。小球藻的光合作用效率高、生长周期短、生物产量高，而且环境适应能力很强。小球藻是一种单细胞绿藻。改变小球藻培养基的化学成分可以使它的生长方式发生改变，由此提高小球藻的生长效率、获得高含量脂肪，并且有利于小球藻细胞内的某些代谢产物（如脂类）的积累，降低生产成本[7]。本研究从加拿大引进了转基因小球藻，它的脂肪酸主要组成为C16和C18脂肪酸，且以C16∶0、C16∶1、C18∶1为主，即双键数目通常为一个，从结构上分析是理想的柴油替代品[8]。本研究探讨影响小球藻生长的条件，优化利用转基因小球藻制备微藻油脂的培养条件，为利用小球藻制备生物柴油打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 藻种 供试小球藻藻种购自加拿大滑铁卢大学。

1.1.2 培养基

1）GM培养基（1 L）：1.8 g尿素，1.25 g KH2PO4，1.00 g MgSO4·7H2O，0.5 g EDTA，0.114 2 g H3BO4，0.111 g CaCl2·2H2O，0.049 8 g FeSO4·7H2O，0.088 2 g ZnSO4·7H2O，0.014 2 g MnCl2·4H2O，0.015 7 g CuSO4·5H2O，0.004 9 g Co（NO3）2·6H2O。

2）SC培养基（1 L）：1.25 g KNO3，1.25 g KH2PO4，1.0 g MgSO4·7H2O，0.5 g EDTA，0.114 2 g H3BO4，0.111 g CaCl2·2H2O，0.049 8 g FeSO4·7H2O，0.088 2 g ZnSO4·7H2O，0.014 2 g MnCl2·4H2O，0.015 7 g CuSO4·5H2O，0.004 9 g Co（NO3）2·6H2O。

取GM培养基与SC培养基按比例混合制成GM-SC培养基。

1.2 方法

1.2.1 培养基氮磷质量比的优化 向培养基添加尿素、KH2PO4调至氮磷质量比（尿素KH2PO4的质量比）为1∶1、3∶2、4∶3和2∶1，并灭菌备用。在超净工作台中将转基因小球藻藻种分别接种在4种氮磷质量比的GM-SC培养基中，并做好标记。将已接种小球藻的锥形瓶置于恒温振荡箱中，温度调节到30 ℃，光照16 h、黑暗处理8 h，以120 r/min振荡培养。定期测定其在600 nm下的吸光度，重复3次，取平均值。用OD600 nm变化来表示小球藻的生长情况。

1.2.2 培养基pH的优化 采用最佳氮磷质量比的培养基配方，用0.5 mol/L的HCl溶液和NaOH溶液调至培养基pH分别为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，在超净工作台中将转基因小球藻藻种分别接种在6种pH的GM-SC培养基中，并做好标记。将已接种的锥形瓶放置于恒温振荡箱中，温度调节到30 ℃，光照16 h、黑暗处理8 h，以120 r/min振荡培养。定期测定其在600 nm下的吸光度，3次重复，取平均值。用OD600 nm变化来表示小球藻的生长情况。

1.2.3 培养温度的优化 将小球藻藻种接种到最适宜条件的培养基中，分别在26、28、30、32 ℃光照16 h、黑暗处理8 h，以120 r/min恒温振荡培养，定期测定其在600 nm下的吸光度，3次重复，取平均值。用OD600 nm变化来表示小球藻的生长情况。

1.2.4 脂肪酸的检测 优化条件后，在最佳条件下培养转基因小球藻，并委托农业部谷物及制品质量监督检验测试中心检测出转基因小球藻的C16和C18脂肪酸（亚油酸、油酸、亚麻酸、棕榈酸和硬脂酸）占总脂肪酸的比例。

2 结果与分析

2.1 培养基氮磷质量比对转基因小球藻生长的影响

由图1可知，当培养基中氮磷质量比为4∶3时，转基因小球藻的生长状况较好；而当氮磷质量比为2∶1时，转基因小球藻的生长状况较差。所以，在试验的范围之内，最适宜的氮磷质量比为4∶3。

2.2 培养基pH对转基因小球藻生长的影响

由图2可知，这种转基因小球藻比较适宜在碱性环境下生长，在pH 8.5～9.0的条件下，转基因小球藻生长较好。在酸性条件下（pH 6.5～7.0），转基因小球藻生长状况较差。所以，在试验的范围之内，最适宜培养基的pH为8.5。

2.3 培养温度对转基因小球藻生长的影响

由图3可知，转基因小球藻在28 ℃的培养条件下生长状况最好，30 ℃的培养条件次之。由此可知，在试验的范围之内，最适宜的培养温度为28 ℃。

2.4 脂肪酸检测结果

委托农业部谷物及制品质量监督检验测试中心检验转基因小球藻的C16和C18脂肪酸（亚油酸、油酸、亚麻酸、棕榈酸等）占总脂肪酸的比例，结果见表1。可见C18脂肪酸含量较高，C16脂肪酸含量一般，用该小球藻制备微藻油脂相对比较满意。

3 小结

利用从加拿大引进的转基因小球藻进行试验，得出以下结论：将转基因小球藻接种在氮磷质量比为4∶3、pH 8.5的GM-SC培养基中，在28 ℃的培养条件下进行培养，最终可得到生产状况较好、生长速度较快的小球藻。试验优化了利用转基因小球藻制备微藻油脂的条件，为利用小球藻制备生物柴油打下了基础。

参考文献：

[1] 谭天伟，王 芳，邓 立，等.生物柴油的生产和应用[J].现代化工，2002，22（2）：4-6.

[2] SHAY E G. Diesel fuel from vegetable oils； status and opportunities[J]. Biomass Bioenergy，1993，4（4）：227-242.

[3] 盛 梅，邬国英，徐 鸽.生物柴油的制备[J].高校化学工程学报，2004，18（2）：231-236.

[4] 汪向阳，陈金思，徐玉福，等.棉籽油生物柴油和柴油混合燃料的特性[J].农业工程学报，2010，26（3）：272-276.

[5] 李小昱，韩鹤友，王 为，等.柴油机应用不同配比生物柴油的经济性和排放特性[J].农业工程学报，2009，25（5）：177-182.

[6] 王一平，翟 怡，张金利.生物柴油制备方法研究进展[J].化工进展，2003，22（1）：8-12.

[7] 缪晓玲，吴庆余.微藻油脂制备生物柴油的研究[J].太阳能学报，2007，28（2）：220-222.

[8] 王 铭，刘 然，徐 宁，等.13种微藻的脂肪酸组成分析[J].生态科学，2006，25（6）：542-544.